Краткая информация:
Казубская Татьяна Павловна, ст. н. с. лаб. клинической онкогенетики, д.м.н.
Адрес:115478, Москва, Каширское шоссе, д.24; тел.,+7 (499) 324-26-85;
E-mail:kazubskaya@yahoo.com
Резюме
Внедрение молекулярно-генетических технологий в клиническую практику способствует идентификации наследственных форм злокачественных новообразований у детей, ранней диагностике и своевременному лечению, обеспечивает возможностью планирования профилактических мероприятий. Описывается использование комплексного анализа клинико- молекулярно-генетических данных в диагностике наследственных форм злокачественных опухолей у детей
Ключевые слова: молекулярная диагностика, генетическое консультирование, наследственные злокачественные опухоли у детей.
T.P.Kazubskaya, V.M.Koslova,F.A.Amossenko, O.V.Babenko, V.G.Polaykov.
THE MODERN PRINCIPLES OF DIAGNOSTICS AND PREVENTION OF HEREDITARY FORMS OF CHILDREN`S TUMORS .
FSBI “N.N.Blokhin RCRC” RAMS, Moscow, Russia
FSBI MGNC RAMS, Moscow, Russia
Resume
The implication molecular- genetic techniqes in clinical practice are promoting the identification of inherited forms of malignant tumors at children, early in diagnosis, timely treatment and are provide possibility of preventive actions. The use of the complex analysis of clinical-molecular-genetics in genetic consulting for diagnosis of hereditary forms malignant tumors at children is described.
Введение
Злокачественные новообразования у детей являются одной из наиболее сложных медико-социальных проблем. Это связано с ежегодным увеличением количества заболевших детей, развитием заболевания в раннем детском возрасте или внутриутробно и прогрессирующим течением.Изучение генетической обусловленности злокачественных опухолей у детей является принципиально важным аспектом в онкологии, поскольку позволяет объяснить этиологию, патогенез, клинический полиморфизм мультифакториальных и наследственных форм этих неоплазий, и обеспечивает разработку методов их молекулярной диагностики. Современные молекулярно-генетические технологии и их внедрение в клиническую практику приобретают особую значимость, способствуя идентификации наследственных форм злокачественных новообразований у детей, ранней диагностике и своевременного лечения, обеспечивают возможность планирования профилактических мероприятий. В работе основное внимание уделяется возможности использования молекулярной диагностики в генетическом консультировании наследственных форм ретинобластомы, нефробластомы и медуллярного рака щитовидной железы.
Результаты и обсуждения
Ретинобластома. Ретинобластома наиболее частая внутриглазная опухоль, которая развивается внутриутробно или в раннем детском возрасте. Эта опухоль быстро прорастает ткани глаза, орбиты, метастазирует в ЦНС и отдаленные органы, что обусловливает высокую значимость ранней диагностики и своевременного лечения. Ретинобластома - первая опухоль ставшая прототипом модели канцерогенеза наследственного рака, разработанной А.Knudson. Cогласно этой модели малигнизация клетки развивается вследствие потери функции обеих аллелей генаRB1. Ген RB1 (хромосома 13q14) из класса онкосупрессорных генов [29]. Известно около 100 мутаций гена RB1, которые чаще всего представляют собой инактивацию одного из аллелей гена посредством делеции, миссенс–мутации, стоп-кодонов и др.[7]. Наследственная и ненаследственная формы опухоли являются результатом мутации одного и того же гена RB1. Примерно у 40% пациентов развитие ретинобластомы обусловлено наличием герминальной мутации в одном из аллелей генаRB1, которая наследуется по аутосомно-доминантному типу с высокой (90%) пенетрантностью. У таких пациентов все клетки организма несут эту мутацию, поэтому наследственная форма ретинобластомы возникает в более раннем возрасте, как билатерально так и унилатерально и мультифокально. В наследственных случаях ретинобластомы мутации в гене RB1 выявляются в лимфоцитах периферической крови, в ненаследственных обе мутации гена RB1- соматические и обнаруживаются только в клетках опухолевой ткани. У детей с герминальной мутацией гена RB1 имеется высокий (26%) риск развития вторых первичных опухолей, таких как остеосаркомы и другие типы сарком, опухоль мозга, легкого, меланомы, молочной железы и др. Важно информировать больного о наличие такого риска [4].
Диагностика наследственных форм ретинобластомы основывается на комплексном анализе клинико-генеалогических, цито- и молекулярно-генетических данных. Известно, что цитогенетический анализ позволяет выявлять наследственную патологию в 6-8 % детей. ДНК-тестирование обнаруживает носителей герминальных мутаций гена RВ1 в 95% случаев наследственных форм ретинобластомы.
К особенностям клинического проявления наследственных форм ретинобластомы относится ранний возраст развития заболевания, билатеральное поражение, характер роста опухоли, как правило, мультицентрический (67%), наличие аналогичной опухоли в семье. Эти признаки позволяют выделять группы риска, требующую постоянного наблюдения и необходимость обследования членов их семей. Сюда же включается редко встречающаяся «трилатеральная» ретинобластома, при которой, помимо билатеральной ретинобластомы, выявляется опухоль в эпифизе.
В нашем исследовании полное клинико-генетическое обследование проведено 295 пациентам с ретинобластомой из 256 семей. Семейная форма ретинобластомы выявлена у 10,9% детей, двусторонние формы диагностированы у 37,8% больных. Опухоли с наследственной предрасположенностью выявлены у 49% больных. ДНК-диагностика гена RВ1 проведено 34 пациентам, из которых, 14- были с билатеральной и 20 - с унилатеральной ретинобластомой. Герминальные мутации в гене RВ1 выявлены у 63,8% и 16,6% этих больных (соответственно), подтвердив наследственный характер заболевания. Согласие на проведение молекулярного анализа получено у 16 близких родственников этих больных, выявлено 3 носителя герминальной мутации в гене RВ1.
При обнаружении герминальной мутации в семье с ретинобластомой, анализ гена RВ1 дает возможность провести дородовую диагностику заболевания, тем самым предоставить возможность родителям планировать деторождение. Пренатальная диагностика проведена в семьях 4-х пациентов с ретинобластомой, что позволило появиться на свет 2 здоровым детям. В случае рождения ребенка-носителя герминальной мутации, он включается в группу риска и при подтверждении диагноза лечение начинается на самой ранней стадии заболевания, предоставляя возможность органосохраняющего лечения.
С идентификацией гена RВ1 появилась возможность предотвращения рождения потенциально больного ребенка с помощью экстракорпорального оплодотворения. Пациентам, перенесшим в детстве ретинобластому с целью профилактики рождения больного ребенка необходимо получить информацию о прогнозе потомства и методах дородовой диагностики.
Нефробластома. Вторая по частоте наследственных форм опухолей у детей является нефробластома или опухоль Вилмса. Нефробластома генетически высоко гетерогенное заболевание, молекулярный патогенез которого до конца не установлен и включает сочетание комплекса молекулярных событий, требующихся для инициирующей трансформации недифференцированных клеток почки, которые в конечном итоге приводят к формированию неоплазии. С манифестацией этого заболевания ассоциируют разные гены WT1,WT2,FWT1, FWT2, WTХ, CTNNB1 и хромосомные локусы, включающие 11р13,11p15.5, 1p, 2q, 7p, 9q, 14q, 16q и 22 [9,11,13,16,17,21]. Ген WT1 (хромосома 11р13) является первым, который был идентифицирован при нефробластоме, его относят к классу онкосупрессоров. [11,15,23]. Точковые мутации в гене WT1 ответственны за предрасположенность к развитию нефробластомы.
Семейные формы нефробластомы встречаются с частотой 2-3%, тип наследования аутосомно-доминантный с неполной (около 60%) пенетрантностью. Мутации в гене WT1 при семейных формах нефробластомы встречаются редко [11,12]. Наследственные формы нефробластомы идентифицируются у 10-30% детей пораженных этой опухолью и чаще всего являются компонентом наследственных синдромов, которых насчитывается более 20 [2,26]. Герминальная мутация гена WT1 выявляется при синдромах, включающих мультисистемные пороки развития урогенитального тракта с высоким риском развития эмбриональных опухолей (нефробластомы, гонадобластомы). К ним относится синдром WAGR(Wilms-tumor, aniridia, genitourinary anomalies, retardation), причиной которого является гемизиготная делеция региона хромосомы 11р13, в котором располагается как ген WT1, так и ген РАХ6 ответственный за аниридию [8,21]. В зависимости от длины делетированного участка обнаруживается полная и неполная форма этого синдрома.
Синдром Дениса-Драша, вызывается миссенс-мутацией в гене WT1 и эти мутации почти всегда встречаются в экзонах 8 и 9 этого гена [12,27].
Синдром Frasier, который вызывается мутацией сайта сплайсинга в интроне 9 гена WT1. [1,12]. Помимо указанных синдромов нефробластома может быть компонентом синдрома Беквита-Видемана, канцерогенез которого включает структурные и эпигенетические изменения локуса хромосомы 11р15.5, где локализованы несколько подвергающихся импринтингу генов: LIT1 (KvLQT), IGF2, H19 и др. [3,14,20,28]. Предполагается, что в этом регионе может находиться второй ген-супрессор опухоли WT2 [9]. Исследования семейных нефробластом обнаружили генетическое сцепление с локусами в хромосомах 17q12-21 (ген FWT1) и 19q13 (ген FWT2) [18,24].
Нами изучены 314 детей с нефробластомой из 307 семей. Семейная форма этого заболевания выявлена у 1,3% из них. Двусторонняя нефробластома выявлена у 18,9% детей. Синдромы (Беквита-Видемана, Дениса-Драша, гемигипертрофии, Сильвера-Рассела, нейрофиброматоз 1 типа, Нунан) идентифицированы у 15,9% больных с нефробластомой. В целом наследственные формы опухоли выявлены в 27,8% случаев
Медико-генетическое консультирование семей с нефробластомой направлено на выявление наследственных форм этого заболевания и идентификацию синдромов, компонентом которых она может быть. Выявление наследственных вариантов существенно затрудняет тот факт, что большинство герминальных мутаций при этом заболевании возникает “denovo”. Любой случай изолированной нефробластомы требует ДНК-анализа, как в лимфоцитах крови, так и в секционном материале, что связано с большой долей соматических мутаций по сравнению с герминальными. В случае обнаружения соматических мутаций риск повторного рождения ребенка с такой же патологией меньше 0,5%, в случае герминальной мутации риск составляет 10-30%. Из-за широкой генетической гетерогенности нефробластомы внедрение в клиническую практику ДНК-диагностики этого заболевания еще недостаточно. Клинически предположить наследственный характер опухоли позволяют ранний возраст манифестации заболевания, билатеральное поражение опухолью, наличие еще одного члена семьи с нефробластомой, синдромы и врожденные пороки развития. Учитывая особенности клинического течения синдромов, каждый ребенок с установленным синдромом требует включения в группу риска с разработкой индивидуального плана наблюдения, включающего ультразвуковое и биохимическое обследование 2 раза в год с целью ранней диагностики эмбриональных опухолей ассоциированных с этим синдромом. Постоянный мониторинг, систематическое обследование ребенка, родившегося с герминальной мутацией, является основой ранней диагностики и своевременной терапии.
Медуллярный рак щитовидной железы. Наследственныймедуллярный рак щитовидной железы (МРЩЖ) составляет около 30% всех случаев этого рака и является компонентом множественных эндокринных неоплазий 2 типа (МЭН2). На основе сочетания клинических признаков они были распределены на три типа: множественные эндокринные неоплазии 2А типа (МЭН2А), компонентом которого является МРЩЖ, феохромоцитома и менее часто аденома и/или гиперплазия паращитовидных желез; множественные эндокринные неоплазии 2Б типа (МЭН2Б), который включает МРЩЖ, феохромоцитому, невриномы слизистых, утолщение нервов радужки и морфаноподобные аномалии скелета; и семейный медуллярный рак щитовидной железы (СМРЩЖ), единственным проявлением которого является МРЩЖ.
В 1993 году при семейной форме МРЩЖ была обнаружена герминальная мутация в гене RET (хромосома 10q11.2) и с тех пор идентификация мутаций гене RET включена в стратегию медико-генетического консультирования МРЩЖ [10,19]. Мутации превращают нормальный протонкоген RET в доминантный трансформирующий онкоген. В отличие от генов-супрессоров для развития рака достаточно мутации в одном аллеле этого гена. У носителей мутации генаRET при синдромах МЭН2 медуллярный рак развивается с вероятностью до 100% и является наиболее частой причиной летальности.
Нами изучены 68 больных с МРЩЖ и 382 родственника. Наследственный МРЩЖ идентифицирован у 29,4% больных, структура которого включает МЭН2А (7,4%), МЭН2Б (11,7%), СМРЩЖ (4,4%) и МРЩЖ как компонент нейрофиброматоза 1 типа (1,4%). При синдроме МЭН2А билатеральное развитие феохромоцитом у больных и их родственников встретились в 50% семей. Возраст диагностики заболевания у членов семей варьировал и в среднем составил 28 лет.
При синдроме МЭН2Б особенности фенотипа позволяют заподозрить синдром в возрасте до 1 года. Если такие признаки заболевания как невриномы и/или другие не распознаются достаточно рано, то диагноз устанавливается с выявлением МРЩЖ. Феохромоцитомы при этом синдроме поражали 60% больных. Возраст поступления пациентов в клинику был от 10 до 18 лет и 90% из них были на поздних стадиях заболевания. При семейном МРЩЖ родственники поражались только сайт-специфическим МРЩЖ, который развивался в более позднем возрасте и в среднем составил 30 лет.
Скрининг герминальных мутаций в гене RET установил у 9 из 12 пациентов с МЭН2А мутацию TGC(Cys)→CGC(Arg) (замена цистеина на аргенин), у 3-х из них- TGC(Cys)→ GGC(Gly) (замена цистеина на глицин) в 634-м кодоне (экзон 11) гена RET. Из 4-х обследованных семей больных МЭН2А прямое тестирование гена RET среди родственников обнаружило 8 бессимптомных носителей герминальных мутаций в возрасте от 3,5 до 42 лет. Из 9 семей с МЭН2Б у 6 больных выявлена одна и та же мутация (Met→Thr) в кодоне 918 (экзон 16) гена RET. У их матерей ДНК-тестирование изменений в гене RET не обнаружило, отцы клинически без признаков заболевания и мутации у больных с МЭН2Б вероятнее всего «de novo». При синдроме семейного МРЩЖ обнаружена мутация TGC(Cys)→CGC(Arg) в кодоне 620 (экзон 10) гена RET.
Молекулярная ДНК-диагностика гена RET позволила установить, что клинический полиморфизм МРЩЖ обусловлен разным положением точковой мутации в одном из цистеиновых кодонов этого гена, что находит свое отражение во взаимосвязи между генотипом и фенотипом (тяжестью проявления заболевания). К настоящему времени мутации гена RET изучены в достаточной мере, чтобы дать более точный прогноз течения заболевания у больных МЭН2 и предоставить возможность классифицировать риск развития МРЩЖ в зависимости от кодона, в котором произошла мутация гена RET. Кодон-специфический прогноз для пациентов включает три уровня риска развития и тяжести проявления заболевания. Высокий риск развития МРЩЖ обусловливают мутации в кодонах 609, 768, 790, 791, 804 и 891, очень высокий риск - мутацией в кодонах 611, 618, 620 и 634 и самый высокий риск, как для раннего развития, так и для метастазирования МРЩЖ обусловлен мутацией в кодонах 883 и 918 [5,25] .
Несмотря на успехи в диагностике наследственных форм МРЩЖ единственным видом лечения этого заболевания является тиреоидэктомия. Кодон–специфический прогноз позволяет давать носителям мутаций рекомендации в отношении возраста профилактической тиреодэктомии. У пациентов с очень высоким риском тиреоидэктомию рекомендуется проводить в возрасте до 5 лет, а для пациентов с самым высоким риском тиреоидэктомию рекомендуется проводить как можно раньше (предпочтительно в первый год после рождения). Для пациентов с высоким риском для возраста профилактической хирургии имеются разные рекомендации – возраст до 5 лет, - до 10 лет и проведение тиреоидэктомии на основании результатов биохимического исследования уровня кальцитонина, который проводится ежегодно, начиная с 6 летнего возраста [5,25].
Профилактическая тиреоидэктомия выполнена у 6 согласившихся на оперативное лечение бессимптомных носителей мутации. Только у двух из них, самых юных пациентов (3,5 и 9 лет), операция былапрофилактической, у остальных обнаружены очаги С-клеточной гиперплазии и медуллярный рак. Послеоперационное наблюдение от 4 до 10 лет (в среднем 7 лет) показало, что тиреоидэктомия, проведенная на доклиническом уровне, имеет более благоприятный исход заболевания, а раннее выявление заболевания на основе ДНК-тестирования может изменить течение МРЩЖ.
Применение RET-анализа дает возможность дородовой и предимплантационной генетической диагностики. Пренатальная диагностика проведена в семьях пациентов с МЭН2А и СМРЩЖ. В случае СМРЖ, у пациентки с мутацией в гене RET во время лечения МРЩЖ наступила беременность, внутриутробное ДНК-тестирование выявило мутацию гена RET в кодоне 620 у плода. Больная решила прервать беременность. В случае с МЭН2А внутриутробное тестирование второго ожидаемого ребенка в семье мутации не обнаружило, родился здоровый мальчик. В случае рождения ребенка-носителя герминальной мутации, он включается в группу риска с возможностью дальнейшего лечения на самой ранней стадии заболевания с применением профилактической тиреоидэктомии.
Молекулярная диагностика проложила путь к индивидуальному клинико-генетическому ведению пациентов с МРЩЖ. Молекулярное тестирование гена RET необходимо проводить всем пациентам с выявленным МРЩЖ и невриномами слизистых оболочек для своевременной диагностики наследственной предрасположенности к синдромам МЭН2. ДНК-диагностику следует начинать с пораженного члена семьи, в случае обнаружения специфической мутации тестированию подвергаются все члены семьи.
Заключение.Применение молекулярно-генетических методов обследования детей с злокачественными опухолями имеют большое прогностическое значение, позволяет выявлять потенциальных больных до появления у них клинических или биохимических признаков развития рака, открывая возможность ранней диагностики, своевременного лечения, дородовой или предимплантационной диагностики и является основой эффективной профилактики наследственных форм этих заболеваний.
Литература.
1. Barbaux S, Niaudet P, Gubler MC, et al.. Donor splice-site mutations in WT1 are responsible for Frasier syndrome. // Nat Genet.-1997- V.17- P.467–4701. 2. Breslow NE, Olson J, Moksness J,et al.. Familial Wilms' tumor: A descriptive study. //Med Pediatr Oncol. -1996- V.27- P.398–403.
3. DeBaun MR, Siegel MJ, Choyke PL. Nephromegaly in infancy and early childhood: A risk factor for Wilms tumor in Beckwith-Wiedemann syndrome. // J Pediatr.- 1998-V.13-P.401–404. 4. Eng C, Li FP, Abramson DH, et al. Mortality from second tumors among long-term survivors of retinoblastoma .// J Natl Cancer Inst.- 1993- V.85, №14-P.1121-1128.
5. Frank-Raue K, Rondot S, Raue F.Molecular genetics and phenomics of RET mutations: Impact on prognosis of MTC.//Mol Cell Endocrinol.-2010-V.322- P.2-7.
6. Friend SH, Bernards R, Rogelj S, Weinberg RA, et al. A human DNA segment with properties of the gene that predisposes to retinoblastoma and osteosarcoma. //Nature.- 1986-V 323- № 6089-P.643-6464.
7. Gallie BL, Zhao J, Vandezande K, White A, Chan HS. Global issues and opportunities for optimized retinoblastoma care. // Pediatr Blood Cancer.-2007- V.49 (Suppl)-P.1083-90.
8. Gronskov K, Olsen JH, Sand A, Pedersen W, et al. Population-based risk estimates of Wilms tumor in sporadic aniridia. A comprehensive mutation screening procedure of PAX6 identifies 80% of mutations in aniridia.// Hum Genet.-2001-V.109- P.11–8.
9. Grundy RG, Pritchard J, Scambler P, Cowell JK. Loss of heterozygosity for the short arm of chromosome 7 in sporadic Wilms tumour .// Oncogene. -1998-V.17- P.395–400.
10. Hofstra RM, Landsvater RM, Ceccherini I, et al. A mutation in the RET proto-oncogene associated with multiple endocrine neoplasia type 2B and sporadic medullary thyroid carcinoma //Nature.-1994-V.367-P.375-6
11. Huff V. Wilms tumor genetics.//Am J Med Genet.-1998- V.79- P.260–267.
12. Huff V. Genotype/phenotype correlations in Wilms' tumor.//Med Pediatr Oncol. -1996, V.27- P.408–414.
13. Kaneko Y, Homma C, Maseki N, Sakurai M, Hata J-I. Correlation of chromosome abnormalities with histological and clinical features in Wilms' and other childhood renal tumors. //Cancer Res.-1991- V.51- P.5937–5942.
14. Koufos A, Grundy P, Morgan K, et al. Familial Wiedemann-Beckwith syndrome and a second Wilms tumor locus both map to 11p15.5.//Am J Hum Genet. 1989, V.44, P.711–9.
15. Kreidberg JA, Sariola H, Loring JM, Maeda M, Pelletier J, Housman D, Jaenisch R. WT-1 is required for early kidney development.// Cell.- 1993-V.74- P.679–91.
16. Mannens M, Devilee P, Bliek J, et al. Loss of heterozygosity in Wilms' tumors, studied for six putative tumor suppressor regions, is limited to chromosome 11. //Cancer Res.-1990- V.50- P.3279 –3283
17. Maw MA, Grundy PE, Millow LJ, Eccles MR, et al. A third Wilms' tumor locus on chromosome 16q. // Cancer Res.-1992-V.52- P.3094–3098.
18. McDonald JM, Douglass EC,Fisher R et al.. Linkage of familial Wilms' tumor predisposition to chromosome 19 and a two-locus model for the etiology of familial tumors. // Cancer Res. -1998-V.58- P.1387–1390.
19. Mulligan L.M., Kwok J B., Healey C.S., et al. Germline mutation of the RET proto- oncogene in multiple endocrine neoplasia type 2A . //Nature.-1993- V.363- P.458-460.
20. Moulton T, Chung WY, Yuan L, et al. Genomic imprinting and Wilms' tumor.// Med Pediatr Oncol. -1996-V.27-P.476–483.
21. Muto R, Yamamori S, Ohashi H, Osawa M. Prediction by FISH analysis of the occurrence of Wilms tumor in aniridia patients. //Am J Med Genet.- 2002- V.108- P.285–289.
22. Olson JM, Hamilton A, Breslow NE. Non-11p constitutional chromosome abnormalities in Wilms' tumor patients. // Med Pediatr Oncol.-1995-V.24-P.305–309.
23. Pelletier J, Bruening W, Li FP, et al. WT1 mutations contribute to abnormal genital system development and hereditary Wilms' tumour. // Nature.-1991-V.353- P.431–434.
24.Rahman N, Abidi F, Ford D, et al. Confirmation of FWT1 as a Wilms' tumour susceptibility gene and phenotypic characteristics of Wilms' tumour attributable to FWT1. Hum Genet.-1998-V.103-P.547–56.
25. Raue F,Frank-Raue K Genotype-phenotype relationship in multiple endocrine neoplasia type 2. Implications for clinical management. // Hormones (Athens).- 2009-V.8- №1- P.23-28.
26. Ruteshouser EC, Huff V. Familial Wilms tumor. // Am J Med Genet.- 2004- V.12- P.29–34.
27. Royer-Pokora B, Beier M, Henzler M, et al. Twenty-four new cases of WT1 germline mutations and review of the literature: genotype/phenotype correlations for Wilms tumor development. // Am J Med Genet. -2004-V.127- P.249–57.
28. Sparago A, Cerrato F, Vernucci M, et al. Microdeletions in the human H19 DMR result in loss of IGF2 imprinting and Beckwith-Wiedemann syndrome.// Nat Genet. -2004- V.36-P.958–960.
29. Zhang J, Schweers B, Dyer MA. The first knockout mouse model of retinoblastoma// Cell Cycle. -2004- V3- P.952-959